球等鞭金藻3010、3011、湛江叉鞭藻、颗石藻（Coccolithus）、牟氏角毛藻等单细胞藻种在以硝酸钠为氮源的固体培养基上不能够正常生长，在以尿素为氮源的固体培养基上生长良好藻种易提纯保种。
作者：陆德祥

关键词:单细胞藻种,固体培养基,保种

氮源单细胞(Unicelluler)藻种的保藏一直是制约工厂化育苗生产中单胞藻正常供应和长期保存的重要因素。通常采用液体保藏方法，周期短、易污染、保藏条件：难以控制，容易造成藻种保种失败。

采用固体培养基保藏，可以通过营养成分的缓释作用，在适宜的条件下延长保藏期2~3年。

但需解决一些关键问题，一是藻种的提纯技术，二是选择合适的固体培养基营养成分，否则接种保藏难以取得良好的效果。国内有关固体培养基保藏藻种的实用技术详细报道不是很多，大部分仅作粗略介绍，有些在实际应用中效果不理想，如金藻门(Chrysophyta)的球等鞭金藻3010、3011、湛江叉鞭藻、颗石藻以及硅藻门的牟氏角毛藻等，按照资料中介绍以硝酸钠为氮源、2％琼脂制成的培养基来培养保存藻种往往失败。而改用以尿素为氮源，5~6‰琼脂制成的培养基保种，藻种生长正常并且易提纯。

其它绿藻门(Chlorophyta)、硅藻门(Bacillariophyta)、和黄藻门(Xanthophyta)等海洋单细胞藻种固体培养基保藏方法也可以用此方法。现介绍如下：

1、材料与方法
1.1 仪器设备：超净工作台、Nikon摄影显微镜、生化培养箱、电热蒸汽压力消毒器、电子天平、电热炉、无菌封口膜、三角锥形瓶、移液管、酒精灯、接种针等。
1.2 试剂药品：纯化琼脂粉、尿素、硝酸钠、磷酸二氢钾、鲁歌氏溶液、柠檬酸铁、硅酸钠、碳酸氢钠、山梨酸钾、EDTA-Na、VB1、VB12等。
1.3 藻类材料：球等鞭金藻(Isochrysis galbana OA-3011、OA-3010)、湛江等鞭金藻 (Isochrysis zhangjiangensis Hu&Liu)、Coccolithus藻、绿色巴夫藻(Pavlova viridis )、牟氏角毛藻(Chaetoceros meülleri Lemmermann)、异胶藻(Heterogioea sp．)、小球藻Chlorella sp.)、中肋骨条藻( Skeletonema costatum Greville)。

1.4 方法：

1.4.1 藻种液的制备：在固体培养基接种前一周将上述单细胞藻种分别无菌接种，目的是确保固体培养基接种时藻群处于指数生长期。

1.4.2 固体培养基的制备：固体培养基制备按照下述(1.4.3)培养基营养成分配制培养液，营养成分的加入顺序依次为N、P、Fe、Si、VB、NaHC03、山梨酸钾、EDTA-Na等。每加入一种营养物质， 都要搅拌均匀，再加入第二种。最后加入琼脂，营养液配好后置于可调温电热炉上加热微融化。趁热分装于100ml的三角锥形瓶中，分装量每瓶约30-40ml左右，三角锥形瓶口采用无菌培养容器封口膜封口。

1.4.3 固体培养基配方：金藻门、绿藻门、硅藻门、黄藻门配方如下：

1.4.4 固体培养基灭菌将分装好的固体培养基放入高压灭菌器，压力15磅，温度121℃，时间三十分钟。

1.4.5 接种与培养在超净工作台上或酒精灯下，将上述藻液接种至已冷却固体培养基中，一般采用接种环刺穿培养基表面划“之”或“井”字线法，接种完毕的固体培养基置于温度20-25℃、自然光照(3000-5000lux左右，避免直射光)的环境条件中培养，约十天，即可发现培养基上有藻落生长。

1.4.6低温保藏将藻落生长良好的固体培养基置于10℃的低温培养箱中，自然光照即可。在此条件下，藻种可以保藏2-3年左右。

2．结果与分析

2.1结果：在藻种接种后一周，部分藻种的固体培养基内藻细胞逐渐繁殖起来，一个月后，发现试验一中绿藻门的小球藻，黄藻门的异胶藻、硅藻门的中肋骨条藻、牟氏角毛藻、金藻门的几种金藻，藻群群落都能正常生长。试验二中除金藻门及牟氏角毛藻外，其他藻都能正常生长。

2.2讨论
(1)试验一与试验二固体培养基中营养成份所不同的足提供氮源的营养盐不同。试验一为尿素，试验二为硝酸钠，可见不同的氮源在单胞藻保种过程中起着不同的作用。分析原因，是因为球等鞭3010、301l、湛江叉鞭藻、牟氏角毛藻等单细胞藻具有尿素酶，能分解尿素作氮源，而利用硝酸钠作氮源，需要将硝态氮还原成铵态氮，这几种藻含有的异养菌较少，又由于处于无菌的环境中，所以藻种在试验一中能正常生长，而在试验二中不能正常生长。

(2)单胞藻的提纯：采用固体培养基接种保藏方法，常发现杂藻藻落存在，可采用接种环将所需藻种重新接种至预备固体培养基中培养保藏，这样反复几次，使藻种得到提纯。

(3)琼脂：在添加琼脂时不能机械的照搬资料中介绍的2%用量，要根据琼脂的质量灵活使用，可预先多做几组培养基试验了解琼脂的特性，不同质量的琼脂所添加的量是不同的，培养基太硬，影响营养盐的缓释，水分易失去，不利藻群的生长，培养基太软又起不到固体低温保存延长保种时间的目的。总之，要具体问题具体分析，有时可根据保种的需要制成半固体状态的培养基，一方面营养盐缓慢释放，另一方面，水分含量较高，培养基不易干燥，有利于藻种的保存。

(4)EDTA-Na：EDTA-Na能络和海水中的重金属离子但同时也将单胞藻生长繁殖需要的微量元素络和掉了，用量要小，一般不能超过5mg/L。在保种时，固体培养基不使用EDTA-Na藻群也能正常生长。