作者：厦门大学 李峰

在微藻培养过程中，需要了解微藻细胞的生长情况和速率，这个时候最常用的方法就是生长曲线绘制，这个时候用血球计数板是最常用的计数方法。本文作者提供利用血球计数板计算藻细胞密度数量的操作步骤和常见问题。

利用血球计数板计数方法

一、血球计数版计数所需的仪器和试剂

图1血球计数版计数所需的仪器和试剂

二、鲁格试剂的配制

即将6克碘化钾溶于20ml水中，待其完全溶解后，加入4克碘充分摇动，待碘全部溶解后定容到100ml即配成鲁哥氏液。（用棕色玻璃瓶装）。

固定浓度：每1000毫升水样加入10-15毫升鲁哥氏液。

三、血球计数版的基本构造：

1、基本结构

血球计数版用优质厚玻璃制成。每块计数 板由H形凹槽分为2个同样的计数池。计数池两侧各有一支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高0.1mm的计数池，如图所示：

                         图2 血球计数版结构示意图

2、计数区

计数区的刻度：计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。计数区边长为1mm，则计数区的面积为lmm²，每个小方格的面积为1/400mm²。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm³，每个小方格的体积为1/4000mm³，如图所示：

图3 计数区示意图,红色区域为16个1/400的小方格组成

四、计数步骤

（1）准备待测藻液（如果浓度过高，进行稀释），用Lugol’s solution固定。 

（2）取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。

（3）用移液器吸取少许藻液（20μl），从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（如图4）。

图4 加样示意图

（4）静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。

（5）在图5中区域（25个中格选5个区域）进行计数。

（6）每个样品重复2-3次。

（7）计算。

      计算公式为：

五、注意事项

为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。如藻细胞位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞不计入本格。见图6：

六、使用技巧

血球计数板在使用中可以用到如下技巧：

1. 为了计数视野清晰，其实可以往水里加点染料，或者加个滤光片，显微镜下看反差会大些，用投射光源不要反射光
2. 一般计数的取样在几微升，要用移液枪
3. 细胞计数板在使用一段时间后，显微镜下看不清格子，记得每次使用完用稀盐酸或者酒精清洗。